如何降低非特異性擴增？

2024-11-25 一、擴增方式擴增方式一般有兩種，對稱擴增和不對稱擴增。1、對稱擴增使用等量的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物量隨著PCR循環(huán)呈指數(shù)增長，一般的PCR，使用的都是這種方式。由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR擴增的過程中會水解探針，導致探針被耗盡，無法用于熔曲分析；若使用抗酶切修飾的探針，可一定程度降低水解，但由于探針阻礙了聚合酶通過，擴增效率會大幅下降。對稱擴增產(chǎn)生的互補雙鏈，會與探針競爭結(jié)合靶序列，不利于探針結(jié)合到靶序列上，熔曲分析可能會出現(xiàn)異常。優(yōu)點：靈敏...

病毒滴度的單位有哪些？

2024-11-22 一、病毒滴度病毒的滴度：單位體積(通常為mL)液體中具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。滴度是一個病毒自身復制的數(shù)量概念，可分為物理滴度和感染滴度。物理滴度是指包含病毒基因組的病毒顆粒的濃度，可以通過通過定量PCR對病毒顆粒的基因組拷貝數(shù)進行檢測，也可以通過測定病毒顆粒中的特定蛋白進行定量，但物理滴度未考慮到病毒活性和感染效率，因此是不準確的。感染滴度是指成功轉(zhuǎn)導細胞的病毒顆粒的濃度，須通過細胞感染實驗來測定，如利用定量PCR對細胞中的病毒基因拷貝數(shù)進行檢測，或通過攜帶熒光的病毒感染細...

IHC染色不均勻分析

2024-11-22 上次我們分享了IHC未染色或無信號的原因分析，這次讓我們來看看IHC染色不均勻是為什么吧。一、組織切片制備解釋：組織切片薄厚不均勻→建議：更換刀片二、組織固定1.解釋：酒精固定不足會產(chǎn)生偽影；→建議：延長固定時間；嘗試不同的固定液2.解釋：固定延遲導致抗原擴散；建議：立即固定組織；可以考慮使用交聯(lián)固定劑三、脫蠟解釋：脫蠟不wan全→建議：使用新鮮的二甲苯四、抗體兼容性解釋：一抗可能結(jié)合其他抗原上的表位→建議：從多抗切換至單抗；嘗試不同的單抗五、透化解釋：細胞膜被破壞，膜蛋白丟...

IHC未染色或無信號原因分析

2024-11-21 IHC未染色或無信號的原因：一、?抗體問題?：抗體與一抗或二抗不兼容、抗體濃度不合適、抗體失效或儲存不當?shù)榷紩е聼o染色。例如，使用抗一抗種屬來源的二抗，確認二抗是否識別一抗的亞型；使用更高濃度的抗體或延長孵育時間；設置陽性對照，確保抗體仍然有效?。二、?抗原修復不足?：固定步驟可能會改變抗體識別的抗原表位，導致抗原修復不足。使用微波或壓力鍋進行抗原修復，確保使用新鮮配置的修復液?。三、?樣本處理不當?：樣本存放時間過長、切片制備不當（如脫蠟不ce底）、組織切片干片等都會影響...

蛋白芯片是什么？

2024-11-21 一、蛋白芯片簡介?蛋白芯片?是一種高通量的蛋白質(zhì)功能分析檢測技術(shù)，主要用于監(jiān)測蛋白質(zhì)之間的相互作用。其基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載體上，然后利用標記了特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過熒光強度分析蛋白質(zhì)的表達數(shù)量和相互作用關(guān)系?。二、蛋白芯片的工作原理蛋白芯片通過將已知的蛋白質(zhì)分子固定在固相載體上，然后捕獲與之特異性結(jié)合的待測蛋白質(zhì)。這些待測蛋白質(zhì)可能存在于血清、血漿、尿液等生物樣本中。通過洗滌和純化步驟后，利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術(shù)測定各點的熒光強度...

如何提取細胞核蛋白？

2024-11-20 本文介紹一下用勻漿器研磨法提取貼壁細胞核蛋白的具體操作。一、前期準備1、臺盼藍染液：取臺盼藍粉劑，將其溶解在10mL的雙蒸水當中配制成質(zhì)量體積比為4%（4%w/v）的臺盼藍母液。在使用時，利用PBS緩沖液將母液稀釋10倍，使其濃度達到0.4%，之后再與細胞懸液混合均勻。2、BufferA：包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值為7.9）、1.5mmol/L的氯化鎂、10mmol/L的KCL、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）。若擔心漿蛋白降解會對核蛋白產(chǎn)生影響...

細胞凋亡的檢測

2024-11-19 一、光學顯微鏡觀察凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂。檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細胞計數(shù)。二、視頻時差顯微技術(shù)細胞培養(yǎng)中常用，通過相差顯微鏡可動態(tài)觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。檢測方法：收集2×10^5細胞/ml培養(yǎng)的細胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態(tài)改變，每隔1分鐘作序列攝影...

PCR擴增反應中的嵌合體是什么？

2024-11-18 PCR實驗中產(chǎn)生的嵌合體你知道是什么呢？它怎么產(chǎn)生的呢？那又如何預防和處理呢？這篇文章讓我們一起了解一下吧！一、PCR嵌合體是什么PCR嵌合體(ChimericProducts)：PCR擴增反應中的嵌合體是指一個PCR產(chǎn)物來自兩個或多個模板分子，通常是由于延伸未完quan導致的?。這種現(xiàn)象通常發(fā)生在PCR反應中，特別是當使用多重PCR或復雜模板時。嵌合體會導致擴增產(chǎn)物中含有非預期的片段，有可能會影響實驗結(jié)果的準確性，甚至導致錯誤的解釋。二、形成原理在PCR反應中，DNA模板在...