LNA在基因檢測(cè)中的應(yīng)用

一、LNA的介紹

鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一種經(jīng)過(guò)修飾的RNA，LNA中一部分核糖上的2'與4'碳連結(jié)在一起。一般可見(jiàn)于A-DNA或RNA。這類核酸可以增加引物或探針（probe）的融解溫度（Tm值），加強(qiáng)這些實(shí)驗(yàn)用物質(zhì)的穩(wěn)定性，可應(yīng)用在即時(shí)聚合酶連鎖反應(yīng)（real-time PCR）等技術(shù)中。近期,鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物在藥學(xué)研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注,有希望成為分子水平治療各種疾病的新突破口.它是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物,結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)2 ′-O,4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體,核糖的2′-O位和4′-C位通過(guò)不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋,并連接成環(huán)形,這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內(nèi)型的N構(gòu)型,降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性,增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架,故其對(duì)DNA、RNA有很好的識(shí)別能力和強(qiáng)大的親和力.與其他寡核苷酸類似物相比,LNA有很多優(yōu)點(diǎn):a.和DNA、RNA互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(ΔTm=3～8℃);b.抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性;c.LNA-DNA雜交物能激活RNase H;d.水溶性好,自由穿入細(xì)胞膜,易被機(jī)體吸收;e.體內(nèi)無(wú)毒性作用;f.高效的自動(dòng)寡聚化作用,合成方法相對(duì)簡(jiǎn)單,部分或wanquan修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動(dòng)合成儀上合成。

二、LNA在基因檢測(cè)中的應(yīng)用

1. LNA引物

用鎖核酸修飾引物大大提高了PCR的效率。PCR上游引物的3'末端經(jīng)LNA修飾后，若3"末端與模板不是互補(bǔ)的，則PCR擴(kuò)增效率明顯降低，即LNA修飾的引物其識(shí)別錯(cuò)配的能力與DNA引物相比大大提高。普通PCR實(shí)驗(yàn)也證明LNA引物可產(chǎn)生較少的錯(cuò)配產(chǎn)物，而DNA引物與模板發(fā)生錯(cuò)配時(shí)卻有大量的錯(cuò)誤產(chǎn)物擴(kuò)增出。與普通的DNA引物相比，LNA引物所用聚合酶用量少,成本效率高。除此之外,LNA引物還可以減少模板用量。研究發(fā)現(xiàn)，在引物中間修飾一個(gè)或三個(gè)鎖核酸效果最jia。將鎖核酸修飾在引物的3'端或5 '端或其他的位點(diǎn),PCR結(jié)果顯示，鎖核酸修飾在引物5'端優(yōu)勢(shì)更明顯。

2.LNA探針

LNA(Locked Nucleic Acid)探針是一種用于核酸檢測(cè)和分析的高效探針，具有增強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性。它們通常被用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)、原位雜交、基因表達(dá)分析等核酸分子生物學(xué)技術(shù)中。LNA探針的特殊之處在于它們的核酸結(jié)構(gòu)中包含了Locked Nucleic Acid,即一種經(jīng)過(guò)修飾的核酸單元。LNA中的核苷酸具有特殊的構(gòu)象，其中的核苷酸環(huán)被修飾以形成一種特殊的結(jié)構(gòu)，使其能夠更強(qiáng)烈地結(jié)合目標(biāo)DNA或RNA。在基因表達(dá)分析中，LNA探針可用于檢測(cè)特定基因的表達(dá)水平。通過(guò)與目標(biāo)基因雜交，LNA探針能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出基因的表達(dá)量，從而幫助研究人員確定基因的表達(dá)模式。這有助于揭示基因的功能和疾病的發(fā)生機(jī)制。突變檢測(cè)是LNA探針應(yīng)用的另一個(gè)重要領(lǐng)域。LNA探針可以與目標(biāo)DNA序列進(jìn)行高親和力結(jié)合，從而準(zhǔn)確地檢測(cè)出突變的存在。這有助于對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷和治療方案的制定。LNA探針還可以用于基因定位和疾病診斷。通過(guò)與染色體雜交，LNA探針可以準(zhǔn)確地檢測(cè)和定位特定基因或染色體片段。這有助于確定基因的位置和功能，同時(shí)也有助于疾病的診斷和治療。

提高 qPCR 探針的熱穩(wěn)定性。摻入LNA核苷酸后，由于LNA在錯(cuò)配位點(diǎn)形成Watson-Crick堿基對(duì)的傾向更強(qiáng)烈，因此qPCR探針通過(guò)單核苷酸多態(tài)性（SNP）區(qū)分等位基因的能力會(huì)大大增強(qiáng)。熱變性研究表明，當(dāng)LNA 摻入在寡核苷酸的特定位置時(shí)，完mei匹配和錯(cuò)配之間的 Tm 值存在顯著差異。因此，在 SNP 測(cè)定中，與天然狀態(tài)DNA探針相比，LNA qPCR探針雜交具有更強(qiáng)的不穩(wěn)定性，因此能夠更好地區(qū)分出錯(cuò)配。

由于可以使用LNA調(diào)整qPCR探針的Tm值，因此可以獲得具有不同GC 含量的幾個(gè)短序列的標(biāo)準(zhǔn)化Tm值。例如，富含AT的天然狀態(tài)DNA qPCR探針通常需要超過(guò)30個(gè)堿基長(zhǎng)（有時(shí)需要超過(guò) 40個(gè)）以滿足擴(kuò)增子設(shè)計(jì)指南，但仍有可能表現(xiàn)不佳。使用LNA qPCR探針，通過(guò)選擇性定 位LNA核苷酸，有助于產(chǎn)生最佳的、具有高度特異性的短探針。較窄的Tm值范圍對(duì)于微陣列和多重PCR應(yīng)用特別有益，特別是當(dāng)探針必須在相同條件下與許多不同靶標(biāo)的同時(shí)結(jié)合時(shí)。