PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見的問(wèn)題及原因分析

　　為了排除某些因素對(duì)PCR結(jié)果的影響，PCR實(shí)驗(yàn)需要對(duì)照實(shí)驗(yàn)。PCR的陽(yáng)性對(duì)照是Marker，推測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度，判斷PCR產(chǎn)物是否是目的片段。PCR的陰性對(duì)照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分與其他管一樣，證明沒有其他模板污染。下面讓我們一起來(lái)看看PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見的問(wèn)題及原因分析吧！
 

　　一、耗材選擇不當(dāng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成很大的影響
 

　　PCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材質(zhì)，因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性。這些材料通常會(huì)與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過(guò)程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。
 

　　PCR管的體積大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因?yàn)榈腿莘磻?yīng)管有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時(shí)，需要避免加樣過(guò)量或過(guò)少。過(guò)量會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過(guò)少可能會(huì)造成樣品蒸發(fā)損失。
 

　　二、假陰性(無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物)——現(xiàn)象：陽(yáng)性對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)
 

　　原因：模板含有抑制物，含量低；緩沖液(Buffer)對(duì)樣品不合適；引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解；反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短。
 

　　對(duì)策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量；更換Buffer或調(diào)整濃度；重新設(shè)計(jì)引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu))或者換一管新引物；降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。
 

　　三、非特異性擴(kuò)增——條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶
 

　　原因：引物的特異性不強(qiáng)、提取模板DNA中可能會(huì)有非靶基因性同源序列；模板或引物濃度過(guò)高；酶量過(guò)多；Mg2+濃度偏高；退火溫度偏低；循環(huán)次數(shù)過(guò)多。
 

　　對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物；適當(dāng)降低模板或引物濃度；適當(dāng)減少酶量；降低鎂離子濃度；適當(dāng)提高退火溫度則減少與同源性非靶DNA的互補(bǔ)程度；減少循環(huán)次數(shù)。四、拖尾——產(chǎn)物在凝膠上呈模糊不清狀態(tài)(彌散)
 

　　原因：模板不純；引物濃度不夠優(yōu)化；Buffer不合適；退火溫度偏低；酶量過(guò)多；dNTP、Mg2+濃度偏高；循環(huán)次數(shù)過(guò)多。
 

　　對(duì)策：純化模板；對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋；更換Buffer；適當(dāng)提高退火溫度；適量用酶；適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度；減少循環(huán)次數(shù)。
 

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