支原體污染的檢測方法有哪些？

支原體污染一般在顯微鏡下不可見，很難察覺，但細(xì)胞會受到極大的損傷，主要通過以下途徑影響細(xì)胞生長及功能。那么支原體污染的檢測方法有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、分離培養(yǎng)法

檢測方法：將待檢樣品接種到適合支原體生長的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，如有支原體污染，液體培養(yǎng)基顏色會改變，固體培養(yǎng)基將會有菌落生長。

優(yōu)點(diǎn)：該方法被稱為支原體培養(yǎng)法的金標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測絕大多數(shù)支原體。

缺點(diǎn)：支原體生長到一定數(shù)量才能判斷是否有污染，檢測時(shí)間長，無法實(shí)現(xiàn)對支原體的快速檢測

二、原位染色法

檢測方法：通過染色試劑（如DAPI、Hoechst 等）對待測細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察待測樣品的熒光判斷支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：可清晰直觀的看到支原體微粒。

缺點(diǎn)：死亡細(xì)胞釋放的DNA也會被染色，在支原體輕度污染時(shí)，較難判斷是否有支原體污染。

三、化學(xué)發(fā)光法

檢測方法：利用支原體te有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測，通過比較檢測試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：檢測快速，僅需15min即可完成檢測。

缺點(diǎn)：該方法只能檢測活的支原體，如果支原體死亡，將無法通過ATP的變化判斷支原體污染。

四、探針法qPCR

檢測方法：設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，通過探針法qPCR高靈敏檢測培養(yǎng)的細(xì)胞等生物材料中是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測快速，可一次性檢測大量樣品，PCR擴(kuò)增后無需電泳分析即可判斷是否具有支原體污染。

缺點(diǎn)：該方法靈敏度很高，因此對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較為苛刻，且需要精密的qPCR儀器。

五、等溫?cái)U(kuò)增變色法

檢測方法：通過設(shè)計(jì)4-6對特異性引物，在一定的恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物進(jìn)行核酸的快速擴(kuò)增，并且通過顏色變化而無需電泳分析即可確定是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn)：不需要反復(fù)的升溫和降溫，不需要精密的儀器，在恒定的溫度下即可對核酸進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，無需電泳分析，通過顏色變化即可判斷是否具有支原體污染。

缺點(diǎn)：對引物要求較高，需要設(shè)計(jì)多對引物，且擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于測序。

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