Trizol法提取RNA的原理與步驟是什么？

RNA 是一種核酸分子，在生物學中扮演著重要的角色。在細胞內，RNA 不僅具有轉錄和翻譯的功能，而且在調控基因表達、細胞信號傳導以及病理機制等方面也發揮著重要的作用。Trizol法是目前普遍使用的RNA提取方法，那么Trizol法提取RNA的原理與步驟是什么？讓我們一起來看看吧！

一、Trizol法的實驗原理

TRIZOL 試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑，它在破碎和溶解細胞時能保持 RNA 的完整性。試劑主要成分為異硫氰酸和苯酚，其中異硫氰酸肌可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使 RNA 與蛋白質分離，并將 RNA 釋放到濟液中。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層(無色)和有機層(黃色)。RNA 存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA 可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的 DNA 和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的 DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。

二、Trizol法提取RNA操作步驟

1. 勻漿并裂解樣本

組織樣本：每10~100mg組織加入1ml TRNsol，建議使用機械勻漿器來勻漿。另外也可 用液氮來破碎組織，用研缽、研杵把組織粉碎后，把粉末轉移至一干凈的1.5ml小離心管中，在15- 30°C放置5分鐘，以che底分離核蛋白復合體。。樣本的體積應不超過所使用的TRNsol的體積的10%，否則會出現DNA污染。

2. 相分離

每1 ml TRNsol中加0.2 ml 氯仿。蓋上離心管蓋子，劇烈地振蕩15sec，在冰上孵育5 min。室溫 下，12,000×g下離心10min。此時混合物分成三層：底層為苯酚氯仿相層（紅色），中間層，和上層水相層（無色）。水相占總TRIZOL的60%，RNAwan全存在于水相中。

3. RNA沉淀

轉移不多于80%上層水相至新的離心管中，往水相中加入異丙醇，每使用1ml的TRNsol，加入 500μl的異丙醇(注：如果是含多糖、多酚的植物樣品，請加入300μl異丙醇的同時加入300μl 0.8M 檸檬酸鈉/1.2M NaCl混合液)。渦旋混勻，室溫下放置10min，然后在4度下12,000×g離心10min，離心前可以在管的側壁和底部看到絮狀膠樣沉淀，這就是RNA沉淀。糖類豐富的樣本：富含多糖的植物樣本或富含糖胺聚糖和蛋白質聚糖的動物樣本需要使用以下的 修飾的沉淀方法來獲得純的RNA。準備1份Buffer A（1.2M NaCl，0.8M檸檬酸鈉）。做完第二步后， 緊接著依次往水相中加入異丙醇和Buffer A （1ml TRNsol加0.3ml的異丙醇和0.3ml的Buffer A）。旋渦混勻，并在室溫下,≤12,000×g離心10min，這一高鹽沉淀會減少復雜糖類的共同純化。

4. RNA洗滌

洗滌RNA:棄上清， 并用75%乙醇洗滌沉淀一次。旋渦混和樣本，并在室溫下以不超過7,500×g 的速度離心樣本5min。注意：75％的乙醇必須用DEPC處理過的滅菌水來配制，否則75％乙醇中 殘留的RNaseA會降解RNA。5. RNA的溶解:小心地吸棄乙醇，短暫離心將溶滴甩到管底，用移液槍小心吸棄殘留的溶液。室 溫下空氣干燥RNA 5-10min。不要用離心干燥裝置或真空干燥裝置，因為過度干燥會導致很難用 水重新溶解RNA。加入適當的DEPC水溶解RNA。

5. RNA再溶解

去上清，置真空或空氣中5-10分鐘，干燥RNA沉淀，（不能在真空中離心干燥）。注意不能將RNA沉淀wan全干燥，這樣會極大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA樣品其A260/280 ratio < 1.6。

用無RNase 水或0.5% SDS溶液重懸RNA沉淀，用槍頭反復吹打幾次，靜置10分鐘，55-60°C。測濃度后-20°C保存。

6. 測濃度

 取2μl 儲存液加入另一個EP管中，再加入98μl無RNase水，離心混勻，以無RNase水作空白對照，測OD260/280值。1OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0視為純度很高。一般濃在1000ng/ml較準。濃度太高要稀釋以后再測定。

7. RNA鑒定

甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA完整性和DNA污染情況。

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